福彩3d多彩网: 常用的免疫酶染色方法

2016/3/24 14:21:59

常用的免疫酶染色方法

福彩双色球开奖 www.regnj.tw 分为以下两种方法:

(一)酶标抗体法

*直接法

*间接法

(二)非标记抗体酶法

*酶桥法

*PAP法

 

(一)酶标抗体法

*通过共价键将酶结合在抗体上,制成酶标抗体,与标本进行反应后,再用酶组化法将酶显色,使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,以供光镜和电镜观察。

-优点:切片能长期保存、反复观察,适于镜下半定量分析。

-缺点:酶与抗体形成的共价键,可损害抗体和酶的活性;易产生非特异染色。

(1) 酶标抗体法——直接法

 将酶直接标记在一抗上,然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物,最后用底物显色剂显色。

(2) 酶标抗体法——间接法

*将酶标记在二抗上,先将一抗与相应的抗原结合,形成抗原抗体复合物,再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合,形成抗原-抗体-酶标抗体复合物,最后用底物显色剂显色。

(a) 酶标抗体间接法的操作步骤

*标本准备:

-石蜡脱蜡至水;

-冰冻切片浸入4°C丙酮固定10min,0.01M PBST漂洗,5min×3;

-细胞爬片先用PBS洗,然后4°C丙酮固定10min,再0.01M PBST漂洗,5min×3;

*石蜡切片需要进行抗原修复,其它标本则不用;

*封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2-甲醇溶液室温孵育5~10min (湿盒内) ;

*0.01M PBST漂洗,5min×3;

*5~10%正常山羊血清(0.01M PBS稀释)封闭,室温孵育30min (湿盒内) ;

*倾去血清勿洗,加1%BSA(PBST配制)稀释的一抗, 37°C孵育60min 或4°C过夜(湿盒内);

*0.01M PBST 漂洗,5min×3;

*加HRP 标记的二抗室温孵育lh或37°C 30min ;

*加0.01%H2O2~0.05%DAB显色 (显色液应新鲜配置);

*经PBS漂洗3次后,梯度酒精脱水,二甲苯透明,明胶甘油封片,显微镜观察。

(二)非标记抗体酶法

酶桥法

*首先用酶免疫动物,制备效价高、特异性强的抗酶抗体;

*以二抗作桥,将抗酶抗体联结在一抗上;

*再将酶结合在抗酶抗体上,经显色显示抗原的分布

-优点:任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对抗体和酶活性的损害,提高了方法的敏感性,而且节省一抗的用量。但抗酶抗体不易纯化。


标签:酶染色法      阅读量:39

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